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考马斯亮蓝染色实验

2023-03-22

如期生物公众号同名,分享实验干货和生信技能,关注领取资料技能包1、实验介绍在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物,由于复合物分子量的不同,在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量

如期生物

公众号同名,分享实验干货和生信技能,关注领取资料技能包

1、实验介绍

在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物,由于复合物分子量的不同,在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量的近似值。

2、样品要求

1、蛋白质样品;

2、5X样品缓冲液。

3、注意事项

胶脱色不能脱的太久,虽然越脱越清楚,但脱的太久了,弱带就看不见了,胶也会变的失真,这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓,就不可以脱太久。但如果要拍照,最起码要保证底色脱完全,要不然照片效果也不会好的。

Bradford法检测蛋白浓度专题

考马斯亮蓝法也称考马斯蓝染色法(coomassie blue staining)又称Bradford法。由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。

考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,最小可测2.5μg/mL蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。

注意:

考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。